纳米抗体制备技巧分享

导读：纳米抗体怪异的物理和化学稳定性等为诊断和治疗供给了新的研讨工具。

重链抗体为驼类和软骨鱼类中自然存在的仅由两条重链组成的特别抗体，包括一个重链可变区（VHH, Variable domain of heavy chain antibody）和两个常规的CH2与CH3区，CH1区自然缺失。重链抗体通太重链上的一个可变区（VHH）连系抗原，该可变区可以零丁稳定地在体外存在，被称为驼类单域抗体(SdAb)大概纳米抗体（Nanobody）。纳米抗体晶体直径为2.5nm，长约4nm，份子量仅为传统完整抗体的1/10（约15kD）但仍然具有完整的抗原识别才能。

纳米抗体相对于传统抗体的上风

与传统抗体相比，纳米抗体还具有人源化简单、亲和力高、稳定性高、可微生物表达、免疫原性低、可溶性好、渗透力强、可识别隐藏表位等上风。纳米抗体怪异的物理和化学稳定性等为诊断和治疗供给了新的研讨工具。在抗体药物研发、医学根本研讨以及疾病诊断和治疗方面越来越受关注。

全球获批上市的纳米抗体药物

2018年欧盟核准全球首款用于治疗成年获得性血栓性血小板削减性紫癜的纳米抗体药物—Caplacizumab，经过阻断超大vWF多聚体与血小板的相互感化，从而避免凝血的发生。2021年康宁杰瑞制药，思绪迪医药和先声药业合作开辟的PD-L1抗体恩维达在中国获批上市，是中国第一个获批上市的纳米抗体药物。今朝，已有多款纳米抗体药物处于临床实验阶段（表1）。

由于纳米抗体的这些特征，越来越多的研讨机构和药物生产企业在分歧的场景中关注、尝试利用纳米抗体。而纳米抗体的开辟分歧于传统单克隆抗体经过杂交瘤制备的方式，它一般经过免疫羊驼、构建噬菌体文库和经过噬菌体展现来挑选出候选纳米抗体，再经过纳米抗体表达和纯化落后行与抗原能否连系的考证尝试。

下面，我们将具体报告挑选制备纳米抗体的流程以及其中的关键点和操纵技能，其中的每一个步调均由深圳康体生命经过屡次优化和总结，供有需要和想尝试纳米抗体挑选的机构参考。

单域抗体制备

获得单域抗体的普遍方式是羊驼经过抗原免疫后经过体内免疫系统的感化使得抗体成熟，分手羊驼外周血B淋巴细胞，提取RNA，反转录获得cDNA，以cDNA为底物PCR扩增获得多样化纳米抗体基因片断，然后将多样化纳米抗体基因片断毗连到噬菌粒上，构建噬菌体库。然后经过噬菌体展现和挑选技术从羊驼抗体库中挑选获得合适的候选纳米抗体并对其停止考证。全部流程首要包括羊驼免疫、噬菌体文库构建、抗体挑选、表达纯化及考证等阶段。

羊驼免疫

每次在羊驼颈部淋凑趣四周分左右两侧皮下注射，每侧分2点注射，每点注射约0.4mL乳化好的抗原。免疫后观察半小时确认羊驼状态杰出，无不适症状。每2周免疫一次，最少停止4次免疫。每次抗原免疫进步行采血用于免疫评价，每次取5 mL血液；血液当天利用预冷25℃离心机，4000 rpm离心10分钟，分手冻存上层血清，用于后续抗体效价检测。在第4次免疫后间隔5-7天从羊驼颈部静脉停止采血50 mL。分手淋巴细胞，-80℃保存。

• 技能：羊驼的挑选和挑选合适的抗原是免疫成功的关键。挑选健康强健、精神状态杰出、体型适中的不免羊驼即空缺羊驼。免疫抗原的纯度以及其正确构象对免疫羊驼后挑选到合适的抗体以及后续利用相当重要，卵白抗原纯度一般最少不低于90%。
• 淋巴细胞的分手：实时的细胞分手可以有用阻止血液收集后的溶血以到达最好的分手结果。
• 免疫周期的挑选可影响免疫结果，按照经历，1-2周免疫间隔可以使羊驼对大部分抗原有杰出的免疫反应。
• 一只不免适龄羊驼可以同时免疫1-3个抗原，每次免疫每种抗原剂量连结在0.5 mg左右，整体积在1.5 mL以下，免疫前将抗原和佐剂体积1:1乳化使其构成均匀夹杂物。

构建噬菌体库

RNA提取：将外周血淋巴细胞冰上消融后加入氯仿震动混匀；室温静置5分钟后离心15分钟；转移上清液加入等体积的异丙醇；颠倒混匀室温静置10分钟后4℃ 12000g离心10分钟；弃上清后用75%乙醇清洗沉淀，4℃ 7500g 离心5分钟后弃去上清，沉淀室温晾干后消融于适当的无RNA酶的水中。

反转录获得cDNA：将RNA一分为二反转录成cDNA。

抗体片断扩增：从反转录的cDNA中扩增特定的抗体片断，利用Taq DNA Polymerase Hot Start酶停止PCR扩增。将获得的PCR扩减产物停止1%琼脂糖凝胶电泳，对0.7 kb巨细的条带切胶利用DNA纯化接管试剂盒停止接管。以上一步PCR扩增并接管后的DNA片断作为模板再次扩增特定的抗体片断，利用Taq DNA Polymerase Hot Start Version酶停止PCR扩增。将获得的PCR扩减产物利用DNA纯化接管试剂盒按说明书接管。

克隆至噬菌体质粒：将上一步扩增获得的多样化抗体基因序列和噬菌体载体停止酶切，各自纯化并停止链接反应。将毗连产物利用DNA纯化接管试剂盒按说明书接管，并利用超纯水消融。

转化TG1：提早将无菌的电转杯置于冰上预冷，待TG1感受态细胞50 µL融化后加入100 ng接管后的毗连产物，将夹杂后的感受态细胞和毗连产物转移到预冷好的电转杯中，利用电转仪预设的Bacteria转化法式电击转化，电转后立即往电转杯中加入1 mL SOC培育基，最少停止20个电转，将细胞37℃苏醒60分钟后涂在含有氨苄抗性的LB培育板上留宿发展。将上一步留宿发展后的培育板上的细胞用2xYT培育基和涂布棒冲洗刮下，加入20%的甘油测OD600nm值后保存在-80℃，即为菌库。

扩增和纯化噬菌体文库：将上一步刮下的菌体混匀后将数目约为10^9个细菌转移到100 mL预先加入氨苄抗生素的2x YT培育液中，37℃ 220 rpm培育直至OD600nm到达0.5。依照帮助噬菌体：细菌细胞数目为20:1的比例加入帮助噬菌体后继续37℃培育30分钟。加入终浓度为50 µg/mL的卡那霉素，30℃留宿摇床培育。将留宿培育的细菌4℃ 13000 rpm离心5分钟，将上清转移到新的离心管后加入1/4体积预冷的 5x PEG8000/NaCl，在冰上孵育30-60分钟。4℃ 13000 rpm离心10分钟去除上清后加入1 mL PBS缓冲液消融沉淀。再次加入250 µL 5X PEG8000/NaCl 后冰上孵育10分钟，4℃ 16000 xg离心15分钟后去除上清并将沉淀消融在1 mL PBS中获得噬菌体库，持久-80℃保存，短期（1-2周）可于-20℃放置保存。

• 技能：噬菌体文库的库容量和多样性是权衡文库质量的重要标准之一，容量越大、多样性越好的库是成功挑选出纳米抗体的有用保证；
• 影响文库容量和多样性的关键点包括：提取RNA进程中RNA的降解、反转录进程中的模板和引物、扩促进程中引物的挑选和模板的用量以及PCR扩增轮数、感受态细菌的转化效力、毗连系统的巨细等身分。

抗体挑选判定

包被免疫管：将50 µg 抗原加入到2 mL PBS中并加入到免疫管中，4℃缓慢扭转留宿孵育。

封锁：将适当扩增和纯化的噬菌体加入到1 mL 3% BSA中，室温扭转孵育2小时。同时往包被好的免疫管中加入2-3 mL 3% BSA，室温扭转孵育2小时。

抗原和噬菌体孵育：将封锁后的免疫管用含有0.01%吐温的PBS洗3次，每次5分钟。将封锁后的噬菌体文库加入到封锁后的免疫管中，增加PBS直至2-3 mL，室温扭转孵育1小时。

清洗：将抗原和噬菌体孵育后的免疫管用含有0.1%吐温的PBS洗20次，每次5分钟。

洗脱：将免疫管内液体弃掉，只管去除残余液体，加入1 mL 0.25 mg/mL Trypsin溶液，室温扭转洗脱30分钟，加入10 µL 10%AEBSF停止洗脱，将免疫管中的溶液转移至新的1.5 mL离心管中，即为第一轮挑选噬菌体洗脱液。

噬菌体洗脱液效价检测：取第一轮噬菌体洗脱液10 µL，在1.5 mL离心管中10倍梯度稀释，共稀释10个梯度，在每个稀释离心管中加入90 µL OD600为0.5-0.55的TG1菌液，混匀后37℃孵育30分钟，将各个梯度的菌液涂布到2×YT固体培育基（Amp）中，37℃颠倒留宿培育，第二天统计培育板上的单菌落个数并计较噬菌体洗脱液效价；

第一轮噬菌体洗脱液的扩增：取500µl第一轮挑选后获得的噬菌体洗脱液至5 mL OD600为0.5-0.55的菌液中，37℃，250 rpm继续培育30分钟，将全数菌液均匀涂布到含有100 µg/mL Amp和2%葡萄糖的2%琼脂糖的固体培育板中，37℃留宿培育。第二天将培育板的菌落刮下来收集至离心管中，即为扩增后的细菌子文库。依照噬菌体文库扩增和纯化方式，再反复挑选进程2次，逐次减半包被免疫管的抗原量，获得3次挑选后的洗脱噬菌体。洗脱的噬菌体可停止NGS测序，获得与抗原连系的候选纳米抗体DNA序列库。

ELISA判定：将最初一轮挑选获得的噬菌体梯度稀释后，各取10 µL加入到OD600nm为0.5的TG1菌液中，37℃培育30分钟后涂布含有氨苄霉素的2x YT培育板上，37℃留宿培育第二天获得单克隆菌落；随机挑选最少192个单菌落停止检测，拔取抗原包被孔与响应对照孔吸光值比例大的菌落送去测序（自力两次phage-Elisa分析），获得候选纳米抗体的基因序列。

• 技能：合适当的抗原包被和抗原的份子量巨细、疏水亲水性质、结构有关，也和包被缓冲液和包被介质的挑选有关，公道的包被是成功挑选的根本，倘使有需要可以停止预尝试肯定包被的条件大概可挑选抗原连系磁珠的方式停止挑选。
• 洗脱后测定噬菌体的效价，经过2-4轮抗原包被淘选后，噬菌体的富集水平需要在公道范围之内。

纳米抗体表达纯化保举流程

Phage-Elisa挑选出的单克隆菌株停止纳米抗体片断DNA测序后即可停止表达纯化及考证。

纳米抗体可在大肠杆菌，酵母或哺乳动物细胞系里停止表达，因其仅含100多个氨基酸残基，为考证其能否与抗原连系，可构建质粒在大肠杆菌中或酵母菌株中停止快速表达及纯化，大概同时在两种菌株中停止表达纯化。

大肠杆菌中纳米抗体的引诱表达及纯化：

质粒构建序列确认后转化表达菌株，如BL21，挑取单菌落停止摇瓶培育后IPTG引诱表达，菌体破裂后将上清液中可溶卵白停止纯化，包括亲和层析，离子交换层析及份子筛层析等方式。

毕赤酵母中纳米抗体的表达及纯化：

质粒构建序列确认后及酶切线性化后将线性化质粒电转进酵母如GS115或X33菌株中，平板上挑选确认单菌落后甲醇引诱表达，排泄至胞外，发酵液上清中的纳米抗体可间接Elisa考证，阳性序列停止纯化。

大肠杆菌表达的优点是可敏捷引诱表达，弱点是部分纳米抗体可构成包容体，其胞内复原情况晦气于纳米抗体中二硫键的构成，毕赤酵母表达的优点是可操纵毕赤酵母对卵白停止胞外排泄，从而不用停止菌体破裂，而间接从酵母发酵上清液中停止纳米抗体纯化，而且酵母很少排泄杂卵白至胞外使得发酵上清液中的纳米抗体纯度相对较高从而易于纯化，而且胞外的氧化情况有益于纳米抗体二硫键的构成，纳米抗体中二硫键的构成对纳米抗体的稳定性相当重要。

候选纳米抗体纯化后可考证其与抗原能否连系及与抗原连系的亲和力检测:

SPR尝试操纵的机型为BiacoreT200，具体操纵流程详见《BiacoreT200检测卵白与卵白连系操纵指南》。

纳米抗体的范围表达纯化：

因纳米抗体为份子量约15KD左右的单链卵白，其可由大肠杆菌或酵母中停止引诱表达并在发酵罐中范围表达，其产量均在g/L以上，故可停止量产利用于试剂盒检测，甚至临床药物范围化量产。

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