蛋白质印迹（Western blotting WB）实验详细操作

卵白质的发现

卵白质是荷兰科学家格里特在1838年发现的。他观察到有生命的工具分开了卵白质就不能保存。卵白质是生物体内一种极重要的高份子有机物，占人体干重的54%。卵白质首要由氨基酸组成，因氨基酸的组合排列分歧而组成各类范例的卵白质。人体中估量有10万种以上的卵白质。生命是物资活动的高级形式，这类活动方式是经过卵白质来实现的，所以卵白质有极为重要的生物学意义。人体的发展、发育、活动、遗传、滋生等一切生命活动都离不开卵白质。生命活动需要卵白质，也离不开卵白质。

卵白质的结构：

卵白质是以氨基酸为根基单元组成的生物大份子。

一级结构:卵白质多肽链中氨基酸的排列顺序,以及二硫键的位置。

二级结构:卵白质份子局地区内,多肽链浴一定偏向盘绕和折叠的方式。

三级结构:卵白质的二级结构根本上借助各类次级键卷盘曲叠成特定的球状份子结构的空间构象。

四级结构:多亚基卵白质份子中各个具有三级结构的多肽链，以适当的方式聚合所构成的卵白质的三维结构。

用约20种氨基酸作质料,在细胞质中的核糖体上，将氨基酸份子相互毗连成肽链。一个氨基酸份子的氨基,脱去一份子水而毗连起来,这类连系方式叫做脱水缩合。经过缩合反应，在羧基和氨基之间构成的毗连两个氨基酸份子的阿谁键叫做肽键。由肽键毗连构成的化合物称为肽。

卵白的研讨方式之一：

卵白质印迹（Western blotting WB）

道理：

与 Southern 或 Northern 杂交方式类似，但 Western Blot 采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋 白质，“探针”是抗体，“显色”用标志的二抗。经过 PAGE 分手的卵白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维 素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附卵白质，且能连结电泳分手的多肽范例及其生物学活性稳定。以 固相载体上的卵白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标志的第二抗体起反应， 经过底物显色或放射自显影以检测电泳分手的特同性目标基因表达的卵白成份。该技术也普遍利用于检测蛋 白水平的表达。

1.Western Blot尝试

(1)卵白质提取

A.收集六孔板内状态杰出的细胞，用胰酶消化后，收集细胞沉淀于 1.5 ml离心管中，1×PBS缓冲液清洗两次，1000 rpm离心5 min后弃掉上清；（消化时代可用枪头缓慢奏乐，有细胞脱落即可，牢记消化过度）

B.按照细胞量加入适当细胞裂解液，卵白酶裂解液和卵白酶抑制剂的比例为100：1，放置于冰上震动10-30min，使细胞充实裂解。然后将样品放入预先制冷到4℃的离心机中，12000rpm,离心5min。

C.离心所得上清即为细胞总卵白。吸收上清放入一个新的EP管中，-80℃保存。

(2)卵白浓度测定

A.利用PierceTM BCA Protein Assay Kit试剂盒停止卵白浓度测定，依照利用说明书将标准牛血明净卵白（Bovine Serum Albumin, BSA）稀释并建造一条标准曲线，得出吸光度与卵白浓度的关系公式；

B.取1 µl卵白样品与19 μl 1×PBS，再加入200μl BCA工作液，37℃孵育30 min，利用酶标仪测其吸光度，在利用以上所述标准曲线公式计较得出卵白浓度。

(3)Western Blot尝试

A.十二烷基硫酸钠-聚丙稀酰胺凝胶配制（Sodium Dodecyl Sµlfate Polyacrylamide Gel Elcetrophoresis, SDS-PAGE）：配制12%的分手胶10 ml，5%的稀释胶3 ml，别离加入至玻璃板中凝固后利用。

表1 配制Tris-甘氨酸SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶电泳分手胶所用溶液

Table9 Preparation of Tris-glycine SDS-PAGE polyacrylamide gel electrophoresis separation gel solution

表2 配制Tris-甘氨酸SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶电泳5%积层胶所用溶液

Table10 Preparation of Tris-glycine SDS-PAGE polyacrylamide gel electrophoresis 5% stacking gel

B.样品预备：计较卵白浓度后，加入5×卵白上样缓冲液，上样缓冲液和总卵白溶液依照1：5的比例夹杂均匀后，100℃水浴煮5 min，立即取出冰上冷却，可放置-20℃保存备用；

C.配胶：将玻板清洗清洁，用单蒸水润洗几次，晾干。然后将玻璃板放置于胶架上，双方牢固。将配制好的分手胶混匀，沿玻板边沿徐徐注入，加入约1ml单蒸水压平（目标是为了排挤气泡，同时保证分手胶液面的平整）。

D.室温凝固：室温下静置30min，待分手胶凝固后，弃掉上层三蒸水，用滤纸吸干残留的液体。然后将配制好的稀释胶充实混匀，加入已凝固的分手胶上，应避免发生气泡，随后渐渐插入10孔梳子，室温待稀释胶凝固后，停止下一步尝试。

E.电泳：将配制好的制胶板放置于电泳槽中，加入配制好的1X电泳缓冲液到指示位置，两块制胶板中心应加满电泳缓冲液，按顺序将卵白Marker、待测样品（尝试前，应从-20℃冰箱中取出，滚水煮5min，瞬时离心）加入胶孔中，80 V恒压跑至条带整洁后，120 V恒压跑至胶板最下沿，应留意制胶板之间能够存在漏液现象；

F.转膜：倒掉两块制胶板之间的电泳缓冲液，取下制胶板，将制胶板谨慎撬开，取出凝胶，按照Marker指示位置切出带有目标卵白的胶条。按照胶条巨细剪出分歧巨细的PVDF膜，作好标志，PVDF膜用甲醇激活45 s，依照一定顺序将海绵，两层滤纸，胶条及PVDF膜，两层滤纸放置于电转槽中，留意电极正负偏向，避免气泡发生，加入1X转膜液，300mA，恒流跑约1.5 h；

G.封锁：配制5%奶粉溶液，将PVDF膜放入封锁液中，室温摇床上缓慢封锁2.0 h；

H.一抗孵育：依照抗体说明书稀释抗体，4℃孵育留宿。

I.二抗孵育：用TBST溶液漂洗PVDF膜3次，每次10 min.依照抗体说明书稀释抗体，室温孵育2 h。羊抗兔二抗稀释浓度1:5000，羊抗鼠二抗稀释浓度1:5000；

J.曝光：配制ECL发光液，A液和B液的比例为1：1,加入4ml离心管中，避光混匀，应先配现用。用TBST溶液漂洗PVDF膜3次，每次10 min。利用卵白凝胶成像仪停止曝光，保存图像后，用image j软件停止定量分析。